細(xì)胞制備：細(xì)胞傳代和培養(yǎng)污染
細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備包括：確保對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有信心所必備的基本技術(shù)。在所有這些技術(shù)中，最基本的是用于傳代細(xì)胞以及制備培養(yǎng)基和試劑的無菌技術(shù)。但還需要有效的方法來冷凍和解凍細(xì)胞系。
細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量將直接轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。為了獲得可以信任的生物學(xué)見解，我們提供細(xì)胞培養(yǎng)工具，為獲得可靠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)奠定基礎(chǔ)。
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控制污染，以免您的實(shí)驗(yàn)因此而終止
細(xì)胞培養(yǎng)的主要挑戰(zhàn)之一是污染，它以細(xì)菌、酵母、霉菌、化學(xué)物質(zhì)、其它生物制劑、細(xì)胞系交叉污染或以上幾種形式的組合出現(xiàn)。污染可能會影響您所培養(yǎng)細(xì)胞的生長、形態(tài)和行為，并最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
細(xì)菌污染
最常見的污染就是細(xì)菌。通常自來水的細(xì)菌污染物含量達(dá)100-1000 CFU/100 mL，但美國材料與試驗(yàn)協(xié)會（ASTM International）設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞培養(yǎng)時，細(xì)菌污染物含量必須小于10 CFU/100 mL。與其它污染物不同的是，細(xì)菌污染通常很容易檢測到，因?yàn)榕囵B(yǎng)物會變得混濁，并且/或者培養(yǎng)基的顏色會發(fā)生變化，導(dǎo)致pH值下降。細(xì)菌在顯微鏡下也很容易看見。
雖然細(xì)菌污染通常很容易檢測到，但它仍然會妨礙你，因?yàn)槟憧赡軣o法立刻注意到它。另外，去污不僅成本高昂，而且很耗時。
為了避免受到細(xì)菌污染：
- 勤于采用無菌技術(shù)，且僅使用無菌試劑
- 留意一般實(shí)驗(yàn)室?guī)齑妫廴颈O(jiān)測往往是其中的一大挑戰(zhàn)
- 務(wù)必留心您的試劑，利用無菌過濾以消除任何污染的可能性
- 水也是一種重要的試劑，因此務(wù)必要使用新鮮制作的超純水作為你的庫存和用于培養(yǎng)基
有助于避免細(xì)菌污染的工具：
支原體污染
支原體污染比較難對付。這些小的（0.15m-0.3m）細(xì)菌沒有細(xì)胞壁，有一層柔軟的細(xì)胞膜。這使得支原體很難通過顯微鏡檢測到，并且由于支原體尺寸較小，即使哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物增殖到較高濃度，細(xì)胞培養(yǎng)物表面也看不到任何明顯渾濁跡象或其它變化。
直到細(xì)胞消失，培養(yǎng)物污染才可能沒那么明顯。
其它受污染細(xì)胞的交叉污染是支原體污染的主要來源之一。消除培養(yǎng)物中的支原體污染幾乎不可能；它對大多數(shù)抗生素有抵抗力，可以在未經(jīng)凍存技術(shù)處理的液氮中存活，污染儲存在同一液氮容器中的其它細(xì)胞。
最好的方法是要防止細(xì)胞系出現(xiàn)全面的支原體污染：
- 定期測試培養(yǎng)物，如有任何支原體培養(yǎng)物呈陽性則丟棄
- 任何外來的新培養(yǎng)物都需隔離和測試
購買或自己制作培養(yǎng)基
您所選的細(xì)胞培養(yǎng)基是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中最重要的方面之一。您的選擇應(yīng)取決于要培養(yǎng)的細(xì)胞類型和培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。不同的?xì)胞系和細(xì)胞類型具有高度特異性的生長要求，并且有許多培養(yǎng)基配方可以滿足您所選細(xì)胞的生長要求。您可以購買現(xiàn)成的培養(yǎng)基（液體或粉末形式皆可）或在實(shí)驗(yàn)室自行制備。無論哪種情況下，水都是細(xì)胞培養(yǎng)基、緩沖液和添加劑的主要成分，而水質(zhì)在任何細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中都起著至關(guān)重要的作用。
應(yīng)使用不含污染物的優(yōu)質(zhì)純水，以確保細(xì)胞是健康的，并且各實(shí)驗(yàn)都應(yīng)采用相同的方式來執(zhí)行。
化學(xué)物質(zhì)或其它生物制劑造成的污染，如內(nèi)毒素、無機(jī)離子和有機(jī)化合物，肉眼無法辨別，可能會影響細(xì)胞的生長、形態(tài)和行為。通常自來水含有1-10IU/mL的內(nèi)毒素污染物，但國際標(biāo)準(zhǔn)<鏈接>規(guī)定：細(xì)胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素污染物應(yīng)小于0.1IU/mL。這意味著水凈化系統(tǒng)需要從用于細(xì)胞培養(yǎng)的水中清除這種內(nèi)毒素。使用正確的水過濾系統(tǒng)，有助于培養(yǎng)健康的細(xì)胞，確保細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)具有一致性和可重復(fù)性。
應(yīng)用手冊
Water is Life: Ultrapure Water in Cell Cultivation
Water is a major component of all cell culture media and is therefore needed to prepare media, buffers, and additives, and as well as to serve many ancillary functions, such as heating, cooling, cleaning and rinsing. Learn how ultrapure water improves the outcome of your cell culture experiments in this application note.
應(yīng)用手冊
Preventing Cell Death: Ultrapure Water System Lowers Endotoxin Content Below Prescribed Limits
The presence of endotoxins can lead to cell death in mammalian cell cultures. For this reason, ultrapure media, i.e., ultrapure water, with levels proven to be below the limits must be used to manufacture biopharmaceuticals or to propagate cell lines or cell cultures. Read our application note to learn how the Arium??pro VF ultrapure water system provides the highest quality, on-demand water that exceeds your requirements for endotoxin-free water.
可使培養(yǎng)基和緩沖液制備可靠且無污染的工具：
細(xì)胞傳代
無論您使用的是貼壁細(xì)胞還是非貼壁細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)都需要定期傳代或再培養(yǎng)。然而傳代會帶來污染風(fēng)險，因?yàn)樾枰蜷_培養(yǎng)瓶對細(xì)胞進(jìn)行操作，并增加新培養(yǎng)基和成分。所有這些步驟都有可能引入污染物。采用適當(dāng)?shù)臒o菌技術(shù)、快速操作并使用最佳工具和未污染試劑有助于降低在細(xì)胞培養(yǎng)中引入污染物的風(fēng)險。尤其是要采用正確的無菌移液技術(shù)，使用無菌過濾移液器和移液器吸頭，以便能夠快速有效地工作，這一點(diǎn)至關(guān)重要。
簡化無菌技術(shù)的工具：
冷凍、解凍細(xì)胞，盡可能減少損壞
成熟細(xì)胞系是您的寶貴資源，但遺憾的是，它們也很脆弱。持續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系可能因細(xì)胞群的衰老、污染和遺傳漂移而有所損失。因此，成熟細(xì)胞系要儲存在液氮中進(jìn)行低溫保存。然而，冷凍和解凍的工藝流程會給這些脆弱的細(xì)胞帶來壓力。儲存于液氮中的細(xì)胞往往通過使用冷凍保護(hù)劑，如二甲亞砜（DMSO）或甘油來進(jìn)一步保護(hù)，免受損害的影響?？焖俨僮鞑⑹褂昧己玫募夹g(shù)對降低破壞這些寶貴的細(xì)胞的可能性也至關(guān)重要。
正確的工具可以幫您快速、高效操作，而錯誤的工具會拖慢您的速度并會影響細(xì)胞。
您選擇的移液器和移液器吸頭對從種子和所建細(xì)胞系的工作庫存中移取細(xì)胞都有影響。與水細(xì)胞培養(yǎng)基相比，含冷凍保護(hù)劑的溶液的表面張力更低。例如，最常用的冷凍保護(hù)劑DMSO在20℃時的表面張力約為43mN/m（水的表面張力為73mN/m）。表面張力低，意味著液體覆蓋移液器吸頭，難以精確移液。使用合適的移液器吸頭，如采用拋光處理表面的低吸附吸頭，可為您確保冷凍保護(hù)劑與細(xì)胞懸液之間保持合適正確比例，從而降低冷凍和解凍期間細(xì)胞損傷的可能性。
