混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) (MLR)
免疫檢查點是調(diào)節(jié)信號，可以充當(dāng) T 細(xì)胞的“開關(guān)”。T 細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞 (APC)（如腫瘤細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞 (DC)）結(jié)合時，檢查點就會啟動。免疫療法（稱為檢查點抑制劑）可靶向 T 細(xì)胞和 APC 之間的這個突觸，特異性地阻斷通常會“關(guān)閉”T 細(xì)胞的免疫檢查點。這會導(dǎo)致 T 細(xì)胞活化和抗腫瘤應(yīng)答增強。目前批準(zhǔn)用于癌癥治療的檢查點抑制劑療法包括抗 PD-1、抗 PD-L1 和抗 CTLA4 單克隆抗體，此外還有多種療法處于研發(fā)階段。
MLR 是一種體外檢測，通過將來自兩個個體的免疫細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，以觸發(fā)免疫檢查點調(diào)控所需的“非自體”識別。該檢測可用于通過評估增強 T 細(xì)胞應(yīng)答的能力來研究潛在療法。通過傳統(tǒng)技術(shù)測定 MLR 中的 T 細(xì)胞應(yīng)答通常存在以下弊端：
- 需要分開進(jìn)行細(xì)胞因子（如 ELISA）、增殖和標(biāo)志物表達(dá)分析（如傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)）
- 使用采集通量較低的儀器，需要大量樣品
- 需要對多個來源（例如，酶標(biāo)儀和 ELISA）的匯總數(shù)據(jù)進(jìn)行手動分析
- 費力費時，需要優(yōu)化方案、固定和反復(fù)洗滌等步驟
在此，我們介紹一種簡單、穩(wěn)健的測定工作流程，用戶可以按照該工作流程使用 iQue? 高通量流式細(xì)胞儀?和經(jīng)過驗證的配套試劑輕松、可靠地測定 MLR 中的 T 細(xì)胞應(yīng)答。用戶可以根據(jù)自己的需求選擇結(jié)合使用一種或多種 iQue? 試劑盒（包括 iQue? 人 T 細(xì)胞活化分析試劑盒和 ?iQue? Qbeads? 人炎癥組合試劑盒）來生成一系列數(shù)據(jù)。用戶可通過將強大的 iQue? 試劑盒與自動化集成式分析相結(jié)合從而完善 篩選和分析研究 ，獲得即時藥理學(xué)數(shù)據(jù)以洞悉新免疫療法對 T 細(xì)胞應(yīng)答的影響
應(yīng)用
檢測原理
圖 1.混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) (MLR) 的分析原理示意圖
在單向 MLR 中，將從一個供體分離的 CD4+ T 細(xì)胞與從另一個供體分離的 DC 相結(jié)合，從而使 T 細(xì)胞發(fā)生單向活化。雙向 MLR 則是將來自兩個不同供體的 PBMC 共培養(yǎng)，使來自兩個供體的 T 細(xì)胞發(fā)生雙向活化。在這兩種分析設(shè)置中，T 細(xì)胞活化都依賴于和 DC（被識別為“非自體”）上 MHC 分子的同種異體反應(yīng)。這取決于供體 HLA 單倍體的差異。通過添加檢查點抑制劑藥物（例如，抗 PD-1 和抗 CTLA4 單克隆抗體），可以增強同種異體 MHC 對 T 細(xì)胞活化反應(yīng)的誘導(dǎo)。用戶可以使用 iQue? 3 和一系列相關(guān)試劑盒（包括 iQue? 人 T 細(xì)胞活化分析試劑盒、iQue? Qbeads? 人炎癥組合試劑盒和定制 iQue Qbeads? PlexScreen 試劑盒）分析單向或雙向 MLR 中的 T 細(xì)胞應(yīng)答。用戶可以根據(jù)自身需求單獨使用或結(jié)合使用這些試劑盒測定增殖、標(biāo)志物表達(dá)和細(xì)胞因子釋放 — 所有測定均可通過單個檢測板完成。
關(guān)鍵優(yōu)勢
同時定量表面標(biāo)志物和細(xì)胞因子表達(dá) -??在單孔內(nèi)獲得多種免疫表型和效應(yīng)細(xì)胞因子濃度的讀數(shù)
獲得定量分析數(shù)據(jù) ?-?生成適用于藥理學(xué)分析的 T 細(xì)胞應(yīng)答測量值
實現(xiàn)高通量分析?-?在 96 或 384 孔板中快速量化標(biāo)志物和細(xì)胞因子，促進(jìn)篩選和分析研究
最大程度地提高分析效率- 通過實時數(shù)據(jù)分析和新穎的可視化工具，縮短獲得結(jié)果的時間
同時定量表面標(biāo)志物和細(xì)胞因子表達(dá)
在單孔內(nèi)獲得多種免疫表型和效應(yīng)細(xì)胞因子濃度的讀數(shù)
圖 2. 在單個孔中測定檢查點抑制劑藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放和標(biāo)志物表達(dá)
先將 DC 解凍并活化過夜（使用 IL-4、顆粒酶 B 和 LPS），然后再以 40K/孔的密度將其接種在 96 孔板中。按照 3:1 的 T 細(xì)胞與 DC 比例添加使用 B/綠色編碼染料標(biāo)記的 CD4+ T 細(xì)胞。添加一系列濃度的檢查點抑制劑藥物“帕博利珠單抗”（一種抗 PD-1 單克隆抗體），增強 T 細(xì)胞活化。在第 2 和 6 天分析細(xì)胞因子樣品。 在檢測終點（第 6 天）分析標(biāo)志物表達(dá)。使用 iQue? 人 T 細(xì)胞活化分析試劑盒和 iQue? 3 平臺分析樣品的 (A) IFNγ 釋放、(B) TNFα 釋放和 (C) CD25 表達(dá)。
獲得定量分析數(shù)據(jù)
生成適用于藥理學(xué)分析的 T 細(xì)胞應(yīng)答測量值
圖 3.通過 iQue Forecyt? 定量分析藥物誘導(dǎo)的 T 細(xì)胞應(yīng)答并自動計算 EC50
將 DC（40K/孔）與編碼的 CD4+ T 細(xì)胞（T 細(xì)胞與 DC 比例為 3:1）一起接種，并使用帕博利珠單抗進(jìn)行處理。在第 2 和 6 天，使用 iQue? Qbeads? 人炎癥組合試劑盒分析 10 uL 樣品。 (A) 每孔 IL-2 (pg/mL) 釋放熱圖。對照孔包含不含藥物的 T 細(xì)胞和 DC。(B-E) 曲線主要顯示的是炎癥細(xì)胞因子釋放隨時間和帕博利珠單抗?jié)舛鹊淖兓?。在?2 天，帕博利珠單抗對 IL-2 釋放影響的 EC50 為 0.53 ug/mL，而到第 6 天，所有 IL-2 生產(chǎn)均已停止。第 2 天到第 6 天，IL-6、CCL2 和 CCL3 水平均上升，第 6 天，CCL2 和 CCL3 釋放對應(yīng)的 EC50 值非常接近，分別是 0.98 和 1.0 ug/mL。
實現(xiàn)高通量分析
在 96 或 384 孔板中快速量化標(biāo)志物和細(xì)胞因子，促進(jìn)篩選和分析研究。
圖 4.使用 384 孔板分析格式針對多對 PBMC 供體快速分析檢查點抑制劑對細(xì)胞因子釋放的影響
單獨接種（單供體對照組）或組合接種（總共 8 對供體）來自多個供體的 PBMC（80K/孔）。用多種濃度的抗 CTLA4 檢查點抑制劑抗體處理細(xì)胞。PBMC 和 PHA 以及 PBMC 和 MMC 的混合物，分別作為陽性對照和陰性對照。3 天后，使用 IFNγ iQue Qbeads? 分析樣品的細(xì)胞因子濃度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度。(A) 熱圖突出顯示了 PBMC 供體對之間抗 CTLA4 誘導(dǎo) IFNγ 釋放的差異。(B) 條形圖顯示 PBMC 混合物釋放的 IFNγ 一直高于單供體對照。這是因為前者添加了 17 ng/mL 抗 CTLA4。(C) 供體對 7 對抗 CTLA4 反應(yīng)的典型濃度響應(yīng)曲線 (EC50 = 6.6 ng/mL)
最大程度地提高分析效率
通過實時數(shù)據(jù)分析和新穎的可視化工具，縮短獲得結(jié)果的時間
圖 5. iQue Forecyt? 可預(yù)設(shè)設(shè)門及自動分析數(shù)據(jù)，可即時提供 T 細(xì)胞活化數(shù)據(jù)
按照一定的 T:DC 比例范圍將來自兩個不同供體的 CD4+ T 細(xì)胞分別與來自單供體的 DC 進(jìn)行共培養(yǎng)。每個 T 細(xì)胞供體與 DC 供體的 HLA 等位基因錯配程度不同。供體 1 T 細(xì)胞的 HLA 圖譜與 DC 供體更相似，等位基因錯配比例只有 3/8（2 個 HLA-A、-B、-C 和 -DR 等位基因），而對于供體 2 T 細(xì)胞，兩者的等位基因錯配比例則高達(dá) 7/8。對照包括單獨培養(yǎng)的 T 細(xì)胞（陰性）或者 T 細(xì)胞與 Dynabead 或 Immunocult 的共培養(yǎng)物（陽性）。使用 iQue? 人 T 細(xì)胞活化分析試劑盒進(jìn)行分析。(A) 板視圖顯示了孔間 CD4+ 細(xì)胞群中 CD25 表達(dá)的差異。T 細(xì)胞活化隨著 T:DC 比例的減小而增強，供體 2 T 細(xì)胞更強。這在意料之中，因為 HLA 等位基因錯配程度高有助于對“非自體”細(xì)胞的識別。(B) 和 (C) 輪廓線圖顯示了供體 1 和供體 2 的 CD25 陽性 T 細(xì)胞百分比（T:DC 比例是 3:1）。(D) 條形圖顯示了 CD4+ 細(xì)胞群中 CD25 細(xì)胞的定量分析結(jié)果 (%)。
MLR 分析工作流程
圖 6.在 iQue? 3 上單向和雙向分析 MLR 的方案
用戶可以根據(jù)需求選擇一系列基于細(xì)胞和微球的試劑盒，并且自定義分析參數(shù)。此分析方法已經(jīng)使用 iQue? 人 T 細(xì)胞活化分析試劑盒、iQue? Qbeads? 人炎癥組合試劑盒和定制 iQue Qbeads? PlexScreen 試劑盒進(jìn)行了驗證。
訂購信息
| iQue? 人 T 細(xì)胞活化分析試劑盒 | ||
|---|---|---|
| 平臺：兼容 iQue? 3/iQue? Screener Plus - VBR 配置 | ||
| 現(xiàn)有規(guī)格 | 產(chǎn)品目錄號 | |
1 x 96 孔 | 90560 | |
5 x 96 孔 | 90561 | |
1 x 384 孔 | 90562 | |
5 x 384 孔 | 90563 | |
| iQue? Qbeads? 人炎癥組合試劑盒 | ||
|---|---|---|
| 平臺：兼容 iQue? 3/iQue? Screener Plus - BR 和 VBR 配置 | ||
| 現(xiàn)有規(guī)格 | 產(chǎn)品目錄號 | |
1 x 384 孔 | 97097 | |
5 x 384 孔 | 97098 | |
| iQue Qbeads? PlexScreen：人分泌蛋白 | ||||
|---|---|---|---|---|
| 細(xì)胞因子 | ||||
| 趨化因子 | TNF | 白介素 | ||
CCL2 (MCP-1) | TNF (TNFα) | IL-1α | IL-10 | |
CCL3 (MIP-1α) | sCD154（sCD40 配體） | IL-1β | IL-11 | |
CCL5 (RANTES) | CD178（Fas 配體） | IL-2 | IL-12/IL-23(p40) | |
| CCL11（嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子） | TNFβ (LT-α/TNFSF1) | IL-3 | IL-12(p70) | |
CD14 | IL-4 | IL-13 | ||
CXCL9 (MIG) | IL-5 | IL-17A | ||
CXCL10 (IP-10) | IL-6 | IL-17F | ||
CXCL11 (I-TAC) | IL-7 | IL-21 | ||
| CX3CL1（趨化因子） | IL-8 | IFN-α | ||
IL-9 | IFN-γ | |||
| 受體 | 粘附分子 | 生長因子 | 酶 | |
CD121a (IL-1 RI) | CD54 (ICAM-1) | 血管生成素 | 顆粒酶 A | |
CD121b (IL-1 RII) | CD62E（E-選擇素） | 堿性成纖維細(xì)胞生長因子 | 顆粒酶 B | |
TNFRI | CD62L（L-選擇素） | CSF2 (GM-CSF) | ||
TNFRII | CD62P（P-選擇素） | CSF3 (G-CSF) | ||
CD106 (VCAM-1) | VEGF | |||
