圖 2. T 細(xì)胞應(yīng)答依賴于活化機(jī)制。 將 PBMCs（120 K/孔）與 Nuclight 綠色試劑標(biāo)記的 Ramos 細(xì)胞（40 /孔）進(jìn)行共培養(yǎng)。使用 CD3/CD28 Dynabead、CD3×CD19 BiTE 抗體或葡萄球菌腸毒素 B (SEB) 誘導(dǎo)活化。在 60 h 時，使用 T 細(xì)胞活化分析試劑盒、T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷分析試劑盒和 T 細(xì)胞耗竭分析試劑盒聯(lián)合 iQue^? 3 系統(tǒng)分析 10 μL 樣本。

每種活化因子會導(dǎo)致不同的 CD3+ T 細(xì)胞蛋白表達(dá)和殺傷特征：

• CD3/CD28 Dynabead 誘導(dǎo)的 T 細(xì)胞活化呈現(xiàn)濃度依賴的特性。最高的微球數(shù)量對應(yīng)于最大的活化標(biāo)志物表達(dá)百分比。該結(jié)果與高水平的細(xì)胞耗竭標(biāo)志物呈現(xiàn)相關(guān)性。
• 與 Dynabead 和 SEB 相比，CD3×CD19 BiTE 抗體介導(dǎo)的靶細(xì)胞死亡增量最多，活化和耗竭水平顯著降低。這說明 BiTE 介導(dǎo)的免疫細(xì)胞殺傷時間可能持續(xù)的較長。
• SEB 刺激，即使在最低濃度下，也可使 T 細(xì)胞活化并產(chǎn)生最大殺傷率，導(dǎo)致高水平的 T 細(xì)胞耗竭。

圖 3.活化機(jī)制直接影響 T 細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放。

使用來自 T 細(xì)胞活化分析試劑盒、T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷分析試劑盒和 T 細(xì)胞耗竭分析試劑盒的 Qbeads 測定 Nuclight 綠色標(biāo)記的 Ramos 和 PBMC（3:1 比例）共培養(yǎng)時細(xì)胞因子的釋放數(shù)據(jù)。在多個試劑盒中均檢測了 IFN? 和 TNFa 的濃度，以便將所有試劑盒的測定結(jié)果取平均值。

各個活化因子對細(xì)胞因子分泌和對表面蛋白表達(dá)的影響相當(dāng)：

• 在使用的微球數(shù)量范圍內(nèi)，CD3/CD28 Dynabead 誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放呈濃度依賴性增加。
• 與微球或 SEB 相比，CD3×CD19 BiTE 刺激后的細(xì)胞因子釋放始終較低（最高刺激濃度下的顆粒酶 B 濃度除外）。該結(jié)果表明，在降低毒性風(fēng)險的情況下（例如細(xì)胞因子釋放綜合征），可以實(shí)現(xiàn)高水平的細(xì)胞殺傷。
• SEB 可誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞因子釋放（即使在低濃度下）。

* 達(dá)到檢測上限

圖 4.記憶 T 細(xì)胞應(yīng)答受刺激方法的影響。將 PBMC（120 K/孔）和 Ramos 細(xì)胞（3:1 E:T 比例）與 3 種不同的活化因子進(jìn)行共培養(yǎng)。在 60 h 時，使用人 T 細(xì)胞記憶分析試劑盒分析 10 μL 樣本。

(A) 圖中顯示了 T 細(xì)胞發(fā)育為不同的記憶 T 細(xì)胞表型時表面標(biāo)志物表達(dá)的改變。從左到右分別為：初始 T 細(xì)胞 (T_N)、干細(xì)胞樣記憶 T 細(xì)胞 (T_SCM)、中央記憶型 T 細(xì)胞 (T_CM)、移行記憶 T 細(xì)胞 (T_TM)、效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞 (TEM)、末端效應(yīng) T 細(xì)胞 (T_TE)、細(xì)胞死亡。

(B)、(C) 和 (D) 圖展示了在記憶 T 細(xì)胞發(fā)育的各個階段表達(dá)蛋白的 CD3+ 細(xì)胞百分比和 IL-10 的釋放數(shù)據(jù)。圖中的藍(lán)色柱代表沒有活化因子的對照組?；疑砀鱾€活化因子 3 個依次遞增的濃度（由淺至深）：CD3/CD28 Dynabead（30 K、120 K 和 480 K 個微球/孔）；CD3×CD19 BiTE（0.12、1.1 和 10 ng/mL）；SEB（1.2、11 和 100 ng/mL）。

BiTE 抗體誘導(dǎo)的活化結(jié)果顯示，與 Dynabead 和 SEB 的刺激相比，晚期階段的記憶 T 細(xì)胞（即 T_EM 和 T_TE）比例最低，早期階段（T_N、T_SCM 和 T_CM）的 T 細(xì)胞數(shù)量較多。這表明 BiTE 抗體的刺激能夠誘導(dǎo)更高水平的細(xì)胞殺傷（如圖 3 所示），同時也使更高比例記憶 T 細(xì)胞能夠保持其自我更新的潛能，從而對抗原產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

圖 5.T 細(xì)胞表征工作流程的分析方案。

使用基于細(xì)胞和微球的試劑盒對 T 細(xì)胞的活化、殺傷、耗竭和記憶進(jìn)行組合式分析，以滿足用戶需求。

圖 6. ?可在與貼壁細(xì)胞系共培養(yǎng)后檢測刺激 T 細(xì)胞的效果。將 PBMCs（25 K/孔）與貼壁 AU565 細(xì)胞（5 K/孔）進(jìn)行共培養(yǎng)。使用 SEB 誘導(dǎo) T 細(xì)胞活化。在 60 h 時，使用 T 細(xì)胞活化分析試劑盒、T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和 T 細(xì)胞耗竭分析試劑盒聯(lián)合 iQue^? 3 系統(tǒng)提取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)行終點(diǎn)分析。

SEB 活化誘導(dǎo)靶細(xì)胞殺傷呈濃度依賴性增加，伴隨 CD3+ T 細(xì)胞上活化（CD69、CD25 和 HLA-DR）和耗竭（PD-1、LAG-3 和 TIM-3）標(biāo)志物的高表達(dá)（在所有使用的 SEB 濃度中均是如此）。