用于活细胞分析的 Incucyte® EV 摄取分析
外泌体和细胞外囊泡 (EV) 均为小膜结合囊泡，通过在细胞之间传输脂质、核酸和蛋白质，在细胞间通讯中起到关键作用。不仅在细胞信号传导、疾病发展和治疗用途递送方面发挥出备受瞩目的关键作用，并且已经证实与癌症、神经退行性疾病和心血管疾病的基本分子机制相关。研究表明，EV 可以将蛋白质、核酸和其他分子从亲本细胞运输到其他细胞中，有望作为诊疗工具发挥强大实力（例如生物标志物或工程化治疗用途递送产品）。
外泌体和 EV 已经在诸多细胞生物学细分研究领域展现出不容小觑的生物学作用，因此迫切需要开发出可靠的分析方法，用于评估此类囊泡被活细胞的摄取情况。一直以来，传统的 EV 标记方法在追踪细胞内摄取情况方面都存在以下痛点：
- 方案繁琐，导致 EV 的丢失和功能受损
- 终点分析测量局限于单个时间点
- 存在污染或细胞健康干扰风险，活细胞分析尚待优化
- 无差别标记细胞会降低 EV 摄取的动力学测量可靠性
The Incucyte® Exofluor 绿色 EV 标记试剂盒经过优化，可与 Incucyte® 活细胞成像分析系统配合使用，能够实时测量同一细胞群内细胞内 EV 的摄取，从而监测其生物功能。 研究人员可以借助该试剂盒获得有关 EV 摄取机制的宝贵见解，更好地推动未来疗法的发展。
EV 摄取分析解决方案
Incucyte® EV 摄取分析概述
Incucyte® Exofluor 绿色 EV 标记试剂盒可对细胞 EV 摄取实现无扰动、实时、动态评估，并经过验证可与配置有绿色/红色或绿色/橙色/NIR 光学模块的 Incucyte® 活细胞成像分析系统配合使用。Incucyte® Exofluor 绿色 EV 标记染料通过与蛋白质和氨基酸共价结合，均匀地标记小型 EV（例如外泌体）的质膜。与 EV 不可逆结合并且可去除游离染料，双管齐下地降低了摄取前或摄取期间染料非特异地附着到其他质膜上的风险。
Incucyte® Cell-by-Cell 分析软件模块
The Incucyte® Cell-by-Cell 分析软件模块可支持一系列贴壁和非贴壁细胞的混合培养应用。可以对贴壁和非贴壁细胞进行非标记细胞计数，随后可按照形状、大小或荧光强度对细胞进行逐个分类，定量分析混合培养中细胞亚群的动态变化，开启全新的探索世界。
产品目录号 9600-0031
利用 Incucyte® 活细胞成像分析系统进行 EV 摄取分析
Incucyte® 活细胞成像分析系统是研究人员在外泌体和 EV 研究中的得力工具。具备实时图像采集和分析功能，外加 EV 摄取分析功能，深入剖析细胞的动态变化。实现 EV 摄取数据与细胞形态、功能和健康测量结果的结合，可通过单个孔洞悉不同处理或培养条件对于 EV 摄取的影响。Incucyte® 活细胞成像分析系统及其集成式软件、Incucyte® Exofluor 绿色 EV 标记试剂盒共同组成了一套全面的方法，对于研究活细胞中的外泌体和 EV 具有很好的帮助。
Incucyte® EV 摄取分析的关键优势
在细胞群水平上，观察并评价细胞内 EV 摄取变化或宿主细胞内的形态变化
均匀标记来自不同提取方法和不同源细胞的 EV
请参阅下面的示例数据
易于遵循的分析设置，可保留 EV 并消除聚集和游离染料
支持 EV 的功能性摄取分析，可通过均匀标记进行动力学测量或下游分析
请参阅下面的示例数据
Example Data for EV Uptake Assay
收集可靠的 EV 摄取动力学测量数据
图 1. 摄取细胞兼容性：使用 Incucyte® Exofluor 染料标记 A549 外泌体（每孔 2 µg，HansaBioMed）。已标记外泌体的摄取可以在各种细胞类型和培养基条件下实现可视化（上图）。每种条件下的仅染料对照孔表明，荧光信号不是由于残留的游离染料造成的（下图）。使用已标记的 A549 衍生外泌体处理各种细胞类型 24 小时后拍摄的图像显示，与对照相比，细胞形态没有变化。
适用于各种来源的 EV
图 2. EV 标记兼容性：图像显示 Incucyte® Exofluor 绿色染料标记的各种 EV 经 A549 受体细胞摄取（处理后 24 小时）。 A549 外泌体通过超滤和 SEC 方法提取 (HansaBioMed)，并在 2 μg/孔的条件下进行处理。 人血浆来源外泌体（Abcam，超滤萃取法）的使用浓度为 4 μg/孔。 MSC 和 HEK293T EV（赛多利斯）均通过 TFF/IEX 色谱法提取，处理浓度分别为 1.5 x 108 和 8.3 x 107 颗粒/孔。
通过简单的方案保留 EV 及其生物功能
图 3. Incucyte® Exofluor 绿色 EV 标记试剂盒分析设置的快速指南。试剂盒内容物有用于去除游离染料的 Vivaspin® 色谱柱，用于在 Incucyte® 活细胞成像分析系统内成像之前灭菌和去除聚集体的 Minisart® 过滤器。
评估 EV 摄取在化合物存在下的动态变化
图 4. EV 浓度依赖性：在通过离子交换色谱（赛多利斯）从 HEK293T 细胞中纯化 EV 之后，使用 Incucyte® Exofluor 绿色 EV 标记试剂盒标记，并添加到 A549 摄取细胞中。在 2 天内每 2 小时采集一次相位和绿色荧光图像，并使用 Incucyte® Cell-by-Cell 软件分析。(A) 将已标记的 EV 滴定约 40 倍（4.2 x 108 至 1 x 107 颗粒/孔），并使用平均绿色荧光均值强度评估摄取情况。观察到相应的浓度依赖性荧光变化。 (B) Phase Object Count（相差成像物象计数）（标准化为 t=0）数据表明在所有测试的 EV 浓度下增殖没有变化。
图 5. EV 摄取由内吞作用决定：将 A549 细胞接种过夜，然后在不含外泌体的培养基中用内吞作用抑制剂 Dynasore（0.01 至 100 µM）处理。 Dynasore 处理后，立即添加用 Incucyte® Exofluor 绿色染料（2 µg/孔）标记的 Hansa A549 外泌体。 外泌体摄取的浓度依赖性抑制 (IC50 = 2.72 µM) 反映在绿色荧光强度上（显示 24 小时数据）。
EV 摄取分析技术资源
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EV 摄取的常见问答
经过验证表明，Incucyte® Exofluor 绿色 EV 标记试剂盒支持多种 EV 分离方法（包括沉淀、超滤、TFF/离子交换色谱和超速离心）。
每个浓缩管或过滤器最多可处理 40 µg 蛋白质或 100 µL 标记的外泌体样品。蛋白质负载量或样品体积过高可能会导致过滤膜堵塞，标记外泌体样品超过 100 µL 将导致背景荧光增加。
我们建议使用 1-4 µg 蛋白质/孔或 5 x 107 - 1 x 109 颗粒/孔范围内的外泌体。
Incucyte® Exofluor 绿色 EV 标记试剂盒不包含 EV/外泌体，仅包含标记染料、Vivaspin® 2 和 Minisart® 过滤器。所有 EV/外泌体和其他消耗品必须由客户提供。
我们的分析试剂盒经过优化和专门设计，可与试剂盒中提供的 Vivaspin®2 浓缩管和/或 Minisart® 过滤器一起使用，与其他耗材混用可能导致信号强度偏差和干扰风险。如有浓缩管或过滤器需求，请向赛多利斯订购（产品指南中提供的产品目录号可能因包装尺寸而异）。
Incucyte® EV 摄取分析应在含有去外泌体血清 (-eFBS) 的分析培养基中进行，以尽可能减少可能影响摄取动力学的内源性外泌体。
虽然 EV 分为三个子类，但本试剂盒仅针对外泌体颗粒进行了验证。 我们尚未测试微囊泡或凋亡小体的标记情况。
我们强烈建议使用 Cell-By-Cell 分析。然而，您也可以使用 Basic Analyzer，但可能需要更多优化。请参阅产品指南了解更多详情。
出于绿色荧光信号的原因，Incucyte® Exofluor 绿色 EV 标记试剂盒适用于 Incucyte® SX5、S3 或 SX1 活细胞成像分析系统。
