圖 1. tau 多肽聚集對(duì)神經(jīng)突長(zhǎng)度影響的慢性體外模型。將原代大鼠皮層神經(jīng)元 (rCortical, Sartorius) 細(xì)胞接種到 PDL 96 孔板中（2×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔），在研究期間將其放置在 Incucyte^? 中。接種后 8 天，用 Tau 溶解物或聚集物（肝素比例 4:1，在 37 ℃ 條件下不定時(shí)旋轉(zhuǎn) 5 天）處理細(xì)胞。對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)進(jìn)行自動(dòng)分段和定量。Tau 聚集物造成了神經(jīng)突長(zhǎng)度（80 ± 5 對(duì)比 166 ± 3 %，2-3 次重復(fù)）出現(xiàn)濃度依賴(lài)性降低，非聚集的 Tau，則僅在 150 μg/mL 濃度下對(duì)神經(jīng)突的形成有巨大抑制作用。

圖 2.在帕金森病動(dòng)力學(xué)模型中，羥多巴胺 (6-OHDA) 處理后細(xì)胞死亡增加同時(shí)神經(jīng)突生長(zhǎng)減少。將大鼠原代紋狀體和星形膠質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)后接種到涂覆有 PDL 的 96 孔板中（密度分別為 2×10⁴ 和 1.5×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔），并使用 Incucyte^? Neurolight-橙色慢病毒試劑 (Sartorius) 進(jìn)行感染。在含細(xì)胞凋亡標(biāo)志物 Incucyte^? Annexin V綠色染料（0.5%；Sartorius）的培養(yǎng)基中，使用 6-OHDA (2-500 μM) 處理感染 10 天后的培養(yǎng)細(xì)胞。使用 Incucyte^? 活細(xì)胞分析系統(tǒng)實(shí)時(shí)獲取熒光圖像。典型圖片顯示了用 6-OHDA（19、56 和 167 μM）和溶劑分別處理 21 天后的比較結(jié)果。時(shí)間進(jìn)程和藥物反應(yīng)曲線顯示，神經(jīng)突長(zhǎng)度（橙色）的濃度依賴(lài)性降低，伴隨相應(yīng)的Annexin V 信號(hào)（綠色）增強(qiáng)，表明了藥物的決定性作用。數(shù)據(jù)表示為平均值± SEM（3 次重復(fù)測(cè)定）。

圖 3.帕金森病模型中的大腦區(qū)域特異性：與皮層區(qū)域相比，6-OHDA 可選擇性地影響黑質(zhì)和紋狀體神經(jīng)突生長(zhǎng)。將大鼠原代紋狀體、黑質(zhì)或皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)后接種到涂覆有 PDL 的 96 孔板中（密度分別為2×10⁴ 和 1.5×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔），并使用 Incucyte^? Neurolight橙色慢病毒試劑 (Sartorius) 進(jìn)行感染。用 6-OHDA (56-500 μM) 處理感染 10 天后的培養(yǎng)細(xì)胞。使用 Incucyte^? 活細(xì)胞分析系統(tǒng)實(shí)時(shí)獲取熒光圖像。柱狀圖和藥物反應(yīng)曲線顯示，藥物對(duì)不同腦區(qū)的神經(jīng)突長(zhǎng)度（橙色）的選擇性作用。溶劑數(shù)據(jù)表明了不同大腦區(qū)域神經(jīng)突形成的差異性發(fā)育。數(shù)據(jù)表示為平均值± SEM（3 次重復(fù)測(cè)定）。

圖 4.功能評(píng)估結(jié)果表明，盡管 Tau 能夠保持神經(jīng)元的連接，但卻誘導(dǎo)了神經(jīng)元活動(dòng)的喪失。將大鼠皮層神經(jīng)元和大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞 (Neuroprime^?, Sartorius) 接種到鋪有 PDL 的 96 孔板中（密度分別為2×10⁴ 和 1.5×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔）進(jìn)行共培養(yǎng)。使用基因編碼的鈣指示劑 Incucyte^? Neuroburst橙色慢病毒 (Sartorius) 感染神經(jīng)元，通過(guò)測(cè)試鈣的波動(dòng)來(lái)監(jiān)測(cè)自發(fā)的神經(jīng)元活動(dòng)。在 Incucyte^? 中，每 24 小時(shí)采集一次圖像（以 3 幀每秒的速率掃描 3 分鐘）。細(xì)胞成熟功能性網(wǎng)絡(luò)形成（14 天）后，使用 AD 相關(guān)的肽 tau（聚集體，300 μg/mL）或蛋白磷酸酶抑制劑 OKA (50 nM) 處理細(xì)胞。圖像顯示了在一次完整掃描中的活動(dòng)范圍（最大/最小熒光反應(yīng)）。鈣跡線顯示了視野內(nèi)所有活動(dòng)對(duì)象的鈣水平波動(dòng)。柱狀圖量化了活動(dòng)對(duì)象的數(shù)量（1/圖）和關(guān)聯(lián)性（連接性）。這些數(shù)據(jù)顯示，與溶劑相比，tau 處理降低了活動(dòng)節(jié)點(diǎn)的數(shù)量（1407 ± 94 對(duì)象/圖 vs. 920 ± 43 對(duì)象/圖），其平均強(qiáng)度分別為（13.7 ± 1.7 OCU vs. 7.2 ± 3.6 OCU），但 tau 處理不影響其關(guān)聯(lián)性（0.95 ± 0.01 vs. 0.97 ± 0.01, 2 次重復(fù)）。與之相反，OKA 降低了相較于溶劑，減少了活動(dòng)節(jié)點(diǎn)的數(shù)量（180 ± 24 對(duì)象/圖）、平均強(qiáng)度（3.8 ± 0.3 OCU），以及關(guān)聯(lián)性（0.27 ± 0.02, 6 次重復(fù)）。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± SEM。

圖 5. 2D 和 3D AD患者來(lái)源的 iPSC 模型顯示出明顯的神經(jīng)突發(fā)育和腫瘤球形成。將健康和 AD（PSEN1 突變）來(lái)源 iPSC 神經(jīng)元 (Axol Bioscience) 接種到鋪有 ReadySet + SureBond 的 96 孔板（2.5×10⁴ 個(gè)細(xì)胞/孔 (2D)），或ULA96 孔板中（5×10⁴ 個(gè)細(xì)胞/孔），然后離心（250 g；10 分鐘）。等待 3 天，使細(xì)胞形成腫瘤球?(3D)，并依照供應(yīng)商的方案誘導(dǎo)神經(jīng)元分化（補(bǔ)充劑 A+B）。2D 研究：使用 Incucyte^? 軟件 (Sartorius) 自動(dòng)定量神經(jīng)突發(fā)育 15 天。時(shí)間進(jìn)程曲線顯示，AD患者來(lái)源的 iPSC 細(xì)胞系的神經(jīng)突長(zhǎng)度比健康對(duì)照組更短（分別是 48 ± 3 mm/mm2，80 ± 3 mm/mm2，3 次重復(fù)）。3D 腫瘤球生長(zhǎng)：使用明場(chǎng)分析以非干擾的方式定量球體大小差異15天。第 6 天在所選孔中加入 Matrigel^? (2.25 mg/mL)，然后對(duì)腫瘤球的形態(tài)和腫瘤球的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行 9 天的觀察。時(shí)間進(jìn)程曲線顯示出兩種細(xì)胞系腫瘤球大小的明顯差異。圖像也顯示出健康細(xì)胞系和阿爾茲海默癥細(xì)胞系不同過(guò)程的發(fā)育能力。